PCR 중합효소연쇄반응에서 사용되는 프라이머의 원리

프라이머란 무엇인가?

프라이머는 복사하려는 표적 DNA 영역의 시작과 끝에 맞춤형으로 합성된 짧은 단일 가닥 핵산 서열(보통 약 18~25개의 염기 길이)

 

프라이머가 표적 DNA를 찾아가서 붙을 수 있게 하는 원리 : 상보적 염기 사이의 수소 결합

• Adenine (A)는 항상 Thymine (T)과 쌍을 이룹니다.
• Guanine (G)는 항상 Cytosine (C)과 쌍을 이룹니다.

만약 표적 DNA 서열이 5'-...AGTCCG...-3'라면, 이에 대응하는 서열인 3'-...TCAGGC...-5'를 가진 프라이머가 온도가 적절할 때 자연스럽게 이끌려가 결합하게 된다.

 

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프라이머 만드는 방법

 

1. 서열 설계 (바이오인포매틱스)

제조에 들어가기 전, 필요한 염기(A, T, G, C)의 정확한 순서를 결정할 것

연구자들은 대개 수작업 대신 전문 소프트웨어(Primer3, NCBI Primer-BLAST 등)를 사용한다.

증폭하고자 하는 DNA의 서열을 프로그램에 입력하면 프로그램이 정방향(Forward) 프라이머(표적의 시작점에 결합)와 역방향(Reverse) 프라이머(반대쪽 가닥의 끝점에 결합)를 디자인한다.

 

두 프라이머가 비슷한 결합 온도(Tm, 보통 55–65°C)를 갖도록 하고, 자기들끼리 뭉치거나 접히는 현상(헤어핀이나 프라이머 이량체 형성)이 일어나지 않도록 한다. (G-C 쌍은 3개의 수소 결합을 가지는 반면, A-T 쌍은 2개만 가진다. 따라서 G와 C가 많을수록 분리하는 데 더 높은 온도가 필요하다. 프라이머의 길이를 조절하여 GC 함량을 약 40–60%로 맞춤으로써 두 프라이머의 결합온도 차이를 1-2도 내로 맞출 수 있다.)

 

2. 화학적 합성 (실제 제조)

 

서열 디자인이 끝나면 이 데이터를 전문 바이오기업에 주문하고, 공장에서는 DNA 합성기(DNA Synthesizer)라는 자동화 장비를 사용해 바닥부터 염기를 하나씩 쌓아 올린다.

https://kilobaser.com/dna-and-rna-synthesizer

 

DNA 합성기(DNA Synthesizer)는 화학 반응(보호기 제거, 결합, 세척) 사이클을 통해 한 번에 하나의 뉴클레오타이드를 추가합니다. 예를 들어 서열이 A-T-G로 시작한다면, 구슬에 A를 붙이고, 그 위에 T를 화학적으로 연결하고, 다시 그 위에 G를 연결한다. 

 

합성이 완료된 프라이머는 실험실에서 사용하기 전에 정제 과정을 거친다. 먼저 완제품 프라이머 사슬을 고체 지지체 구슬에서 화학적으로 떼어내고, 염분을 제거하거나 HPLC, PAGE 같은 기술을 이용해 중간에 합성이 끊긴 불완전한 조각이나 잔류 화학물질을 걸러낸다.

 

정제된 프라이머는 동결 건조되어 흰색 가닥/분말 형태로 작은 튜브에 담겨 연구자에게 배송되며, 연구자는 이를 멸균수에 녹여 PCR 실험에 사용하게 된다.

 

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DNA 합성기의 원리 및 역사

 

일반적인 플라스틱이나 금속은 DNA 합성에 사용되는 강력한 유기 용매에 녹거나 반응하므로,  엔지니어들은 화학적으로 전혀 반응하지 않고 표면이 극도로 매끄러운 테플론(PTFE)이나 사파이어 밸브 같은 특수 소재를 사용해 내부 관을 만든다. 또한, 주사기에 정밀 스테핑 모터를 부착하거나 특수 공압 시스템을 사용하여, 액체를 마이크로리터 단위까지 오차 없이 정확하게 반응 컬럼으로 밀어 넣을 수 있도록 설계한다.

 

DNA를 만드는 화학 조각(포스포라마이디트)들은 공기 중의 미세한 수분이나 산소가 기계 내부로 유입되면 시약이 즉시 변질되어 DNA 사슬이 끊어진다. 따라서 엔지니어들은 시약 병과 관 내부에 항상 아르곤이나 질소 같은 불활성 가스를 채워 넣어 약간의 양압을 유지한다.  가스가 보이지 않는 보호막 역할을 하여 외부 공기를 밀어내고 내부를 완벽하게 건조한 상태로 유지한다.

 

사람이 수동으로 밸브를 빠르고 정확하게 열고 닫을 수는 없으므로, 컴퓨터 프로그램을 통해 염기 하나를 붙일 때마다 수십 개의 밸브를 정해진 순서대로 열고 닫는다.

 

1980년대 이전만 해도 아주 짧은 DNA 가닥 하나를 합성하려면 숙련된 화학자들이 실험실에서 몇 주, 때로는 몇 달 동안 지루하고 위험한 수작업을 반복해야 했다.1981년, 콜로라도 대학교의 카루더스 박사 연구팀은 포스포라마이디트(Phosphoramidite) 화학 기술이라는 혁신적인 방법을 개발했다. 염기 머리에 '모자(보호기)'를 씌워 안전하고 효율적으로 하나씩 쌓아 올리는 기술이다. 이 새로운 화학 반응은 매우 안정적이고 빠르며 정확했기 때문에, 사람이 손으로 하던 과정을 기계로 자동화할 수 있는 길을 열어주었다.

 

이 화학적 원리를 실제 상업용 기계로 바꾸기 위해, 카루더스 박사는 리로이 후드(Leroy Hood) 박사 등 다른 과학자들과 함께 1981년 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems, ABI)라는 회사를 공동 설립하게 된다. 1983년, ABI 사는 세계 최초로 크게 성공한 상업용 DNA 합성기인 ABI 380A를 출시했다. 소형 냉장고만 한 크기였던 이 장비는 내장된 간단한 마이크로프로세서를 통해 액체의 흐름을 제어했다. 이 장비는 분자생물학 혁명의 중추가 되었으며, 이후 인류의 유전체 정보를 밝혀낸 인간 게놈 프로젝트의 성공에 결정적인 기여를 했다.